パンを研究する中で

日々パンの研究、教育をする中で考えていること。
～神戸女子大学名誉教授  瀬口  正晴～

市販のELISAキット

ふつう利用できるアッセイはCodex レギュレーションにとり重要な必須条件であるが、僅か２−３の進んだELISAテストのみが市販試験キットにされた。サンドイッチELISAはPAbを用いたものがRiedel-de Haen AG (Seelze,独；article no.45213)から出された。抗血清はいろいろな小麦品種からの天然のグリアジンと同一品種のグリアジンの加熱変性したものの混合物をウサギに免疫してつくられた。ミクロタイター板（ポリスチロール）はPAbでコートされている。検知抗体はhorseradish peroxidaseでラベルされており、基質溶液にはtetramethylbenzidine/peroxideを含んでいる。グリアジンスタンダードは、13独小麦品種のミックスを70%エタノール抽出された物を用いた。マトリックス効果を押さえるために、サンプル抽出物は分析前に1:5000に薄める。検知限界は、100mgグルテン/kg食品で、結果的にはグルテンフリー食品の制御にはあまりに高すぎる。サンプルは１時間で調製し、2.5時間内に実験を行なう。

　サンドイッチELISAはSkeritt and Hill（1990）によって進歩し、いくつかの会社で商品化され、たとえばCortecs(UK), Transia (France ), R-Biopharm (独)である。ω--グリアジンに対し２種のMAbをウェル壁に付着し、他の抗体はHorse radish peroxidase　を結合し、基質percarbamide が検知に用いられる。発光体は2, 2'-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid)(cortecs)あるいはtetramethyl benzidine (Transai, R-Biopharm)である。グリアジンスタンダードは小麦粉品種Timgalen)の40%エタノール抽出によってつくった。サンプルは40%エタノールで抽出され、1:100に希釈することで進められた。検知限界は約10ngグリアジン/mLであり、感度は会社から20-100mg/kgと示された。アッセイはリングテストでうまく行き, Association of Official Analytical Chemists (AOAC)で確認された。サンプルの数の分析（ソバ，米粉、コーン、小麦デンプン）は、グリアジンを入れこんだものであるが、しかしながら、同じω-グリアジンに対するMAbをベースにした異なった市販のELISAキットとはその結果に大きな違いがあった。そこで著者は結論にしたのは、キットでは信頼を持って未知サンプル中のグリアジン含量を決めることは不可能であると。

グルテンフリー食事のコンプライアンス改良するために、家庭用に簡単なプロトタイプの基本形の試験キットを作った。食品からは希釈塩酸で抽出し、その抽出液の１ドロップを抗体でコートしたチューブに入れ、酵素--ラベルした抗体を加え、３分後、チューブは洗われ発色剤を加える。反応は２分後、硫酸を添加で止まる。家庭用キットは、定量的な実験室用キットと比較すると、定性的一致は非常にある。キットは食品を区別し、グルテンのわずか入った食品（グルテンフリー食品として認められる）と、もう少し多く入ったもの、しかしグルテン含量は受け入れられないもの、とを区別出来た。

　ω-グリアジンに対するMAbの重大な欠点は、このタンパク質タイプの比率は小麦、ライ麦、大麦の貯蔵タンパク質によると比較的低く、強い品種に偏ることである。例えばグリアジンの16小麦品種野タイプの重量値は全グリアジンの6.2-20.0%の範囲を示し、そこでその方法はかなりのシステム的エラーのもとになる。これはいろいろな小麦品種（ふつうのもの、durum小麦、spelt, emmer, einkorn）からのグリアジン区分に基づく研究によってはっきりした。計算カーブはグリアジン区分の同一のタンパク質レベルにもとづいたもので、キットレフェランスグリアジンは大きくちがっており、そのため区分のグリアジン含量は一部、強く下回ったり、あるいは上回ったりする。

　サンドイッチELISSAでR5MAbにもとずくものがR-Biopherm (独)，Ingenasa(Spain)から出された。R-Biopharmは4つの異となったKitをだし, 小麦、ライ麦、大麦からのプロラミンの検出をした。

全てのシステムは、レフェレンスグリアジンに適合（応）され、それはvan Eckert et al 2006にのべられ、２つの抽出方法が提案された（1 gサンプル/10mL）；(i)60%エタノールで正常に抽出、（ii）とくに加熱変性サンプルに対していわゆるカクテル（上を見よ）で抽出された。Ridascreen R Test Gjiadin (R7001)は3 X 300分インキュべーション時間をすすめ、６個のレフェレンス濃度、5ng/mLでスタートするものを供給した。検出限界は、両方のキットで5-10mgグルテン/mLとわかった。3番目のテスト、Ride^R Quick Gliadin (R7003)は側方流動技術をベースにし、stickをふくむキットによるもので、そこにMAbが固定されている。そのstickは希釈サンプル抽出中に入れられ、もしサンプルに適当なプロラミンが入っていれば５分後、赤いラインが見える。アッセイは約10mgグリアジン/kgの感度である。このアッセイはとくに適しているのは綿棒法で、プロラミンのコンタミ用の機械あるいはテーブルのような環境用のもののチェクに対して適している。Stickキット（stickグルテン）はOperon, S.A.(Guarte de Huerva, Zaragoza, spain)でも売っている。最近、４番目のテストがR.Biopherm, Ridascreen ^RGliadin Competitive (R7011)から紹介された。このアッセイはプロラミンからくる小ペプチドの検知ができ、とくにプロラミンの部分加水分解されたものですすんだ、例えばそれは大麦抽出物、ビール（前述見よ）のような物である。Ingenasaは200のELISA システムを商品化し、それはR-Biopherm R7001とR7002に相当するものであり、Ingezim Gluten, Ingezim SEMIQである。

　２つのキット（Ridascreen GliadinとIngerasa Ingezim Glute,）はリングテストに入る。20の研究所は12のコードしたサンプル（グリアジンを添加したあるいはグリアジンのコンタミ）のグリアジン含量の評価の為のコードしたフォームで参加し、各抽出物３段階に希釈したものを用いて２回の実験を行なった。両キットで得られたデータの統計処理は11-25%の繰り返し性があり、23-47%の再現性だった。はっきりとグリアジンのなしと含まれたサンプルの間の区別ができた。両キットはグリアジンコンタミの測定が有効であり、そして3.0mg gluten/kgの感度で保証した。2005年 R5ELISAはThe Codex Comitte of Method of Analysis and Sampling (CCMAS)によってタイプI法として指示され，そして最近のDraft Revised Codex Standard CL 2006/5-NFSDU(2006)によって推薦された。

電子科学センサー（Electrochemical sensors）

最近、Institut fur Mikrotechnik Mainz (IMM), これはEU　プロジェクトCD-CHEFによって設定されたのだが、食品のグルテン含量（www.Imm-mainz,de）の測定にチップシステムを発表した。検知のためにELISAのいろいろなフォーマットと酵素リンクさせたオリゴヌークレオチッドアッセイ（ELONA）が生まれ，それでグルテンタンパク質の認知が可能だった。全てのセンサーは平常のものでレセプター分子（抗体あるいはペプチド）は基質表面に固定する。抗原の結合後、酵素反応が引き金であり、その結果蛍光あるいは電子化学信号が出る。オペレシエル検知のためにチップがデザインされ、そこでは多くのbeam-guiding成分がまとめられる。2つのエレクトロード（電極）（ワーキング電極として金板、レフェレンス，カウンター電極としてAg/AgCl層）が、チップ中に電流測定用センサーとしてある。さらに研究がこれらのチップシステムの有用性のために改良されねばならない。

ポリメラーゼ鎖反応(Polymerase chain reaction)

ポリメラーゼ鎖反応（PCR）は、特異的DNAの決定に基づいている。タンパク質分析とくらべ、DNA分析は大きさの点で数オーダーさらに感受的である。あるDNA配列の2-3分子は10⁶-10⁸のファクターで短時間のうちに増強できる。PCRは加熱したものにまた応用されたがそれはDNAはタンパク質よりかなり加熱安定であるためだ。最初のPCRのステップはDNA抽出と加熱である。それは変性と単一の系に分離をすることが出来る。つづいて、プライマー（ターゲットDNAのあるポーションに対する相応する基本配列をもつオリゴデオキシヌークレオチド）は加えられ、１本の糸の相応するセグメントとハイブリダイズする。４個のデオキシヌークレオチド５'--トリフォスフェートとサーモステーブルDNAポリメラーゼを添加して新しいコンプリメンタリーストランド（糸）が合成される。DNAは20-30回のステップの繰り返しで増幅され、電気泳動的に分析される（定量PCR）。定量PCRにとってまた"real -time PCR"と呼ばれるが、オリゴデオキシヌークレオチドで蛍光あるいは酵素マーカーでラベルされたものは用いられて、そして定量は蛍光あるいは色の強さで測定される。計算はスタンダードDNAフラグメントで行なわれた。両定性、定量PCRは自動的にDNA-Thermal Cycleの測定によって行なわれた。

　Switzerland、ベルンのLuthylのグループは，初めてグルテン分析に対してPCRを用いた。Allmann et al (1993)は高度に保護された真核生物DNA配列に対する特異的なプライマーを用いたが、それはPCR増幅に供して可能であるものである。分離して核酸基質を与える物である。このアッセイは35異なった食品サンプルをテストし、大麦添加から加熱加工食品のサンプルまでがある。小麦デンプンは非常に低いグリアジン含量であるが、強くポジテブに反応し、さらに純粋なグリアジンあるいはグルテンで添加物としたものは検知されなかった。PCRとELISA(Ridascreen ^RGluten Kit)は、小麦を入れたオートサンプルの分析によって比較された。その結果は次の事を示し、小麦PCRシステムはELISAシステムより10倍感度が高く、分離されたDNAは増幅される事が示された。

　定量的コンペテテブ（QC-）PCRシステムは、Dahinden et al (2001)によって展開され、小麦、ライ麦、大麦のコンタミの検知に用いられた。このシステムは同時に小麦、ライ麦、大麦DNAを認知し、それはクロロプラストtrnLジーンの非コーデング域のベースに基づく物である。内部DNAストランドは20bp添加で元のPCR生産物につくられる。QC-PCRシステムは15商業上利用出来るグルテンフリーとラベルされた食品に応用され、ELISA（Ridascreen^RGluten Kit）と比較した。両方法とも殆どの場合同一の結果を示した。そしてグルテンフリー食品のテストに互いにサポート出来る事が提案された。

　リアルタイムPCR利用メルテイグカーブ分析による食品の同定はSandberg et al（2003）によってつくられ、とくに小麦、ライ麦、大麦、食品サンプル中オートコンタミ区別用に作られた。PCR法はELISAと良い相関性があった（Transia Plate Gluten ）。ゲル電気泳動を用いた融解曲線分析の有用性は、分析が同じ閉鎖したキャピラリーを増強の為に用いており、このためサンプル間のコンタミの危険性は除去された。Henterich et al （2003）は、グリアジン検知用one-stepリアルタイム免疫--PCRを導入した。この技術では，R5MAbはオリゴヌクレオチドと結合する；グリアジン分析の感度はELISAで達するレベルより30倍以上増加する。

　Mujico et al (2004, 2005)は、小麦、ライ麦、大麦DNAの測定のた３つの異なるリアルータイムPCRシステムを進歩させた。3システムの結合で、穀物のタイプの区別のみならず、小麦、ライ麦、大麦のオートサンプルへのコンタミの比率も決めた。この研究で示されたデータは殆どのオートサンプルはコンタミであり、主には大麦であった。PCRとR5ELISAの比較で、トウモロコシ粉、未加熱製品サンプルの分析比較は良い相関性があった（Mujiro and Mendez, 2006）。サマリーとして、実質PURシステムの進歩は，免疫法（例えばELISAとWestern blot）に対しグルテン分析捕捉的なものとして感度の高い方法である事がわかった。ビール、シロップ、モルト抽出のような加水分解された食品からのDNAはしかしながらPCRシステムでは、検知できない。

マススペクトロメトリー

最近matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)がタンパク質の分子マス決定に重要な方法となって来た。この技術は1000から100000までのマスの同時測定ができ、そこではクロマト的なピュアリフィケーションはできないが数分で低ピコモルの範囲で出来る。その完全のタンパク質であるのみならず，加水分解されたタンパク質でも分析できる。MALDI-TOF MSは３パーツに分かれている；マトリックスへの分析物の結合、レーザーによる分析物のイオン化と脱着、マススペクトロメ−ターによる分析物の分離と検知である。マトリックス（例えばSINAPINIC ACID）は適当な揮発性ソルベントにとかし、分解物と混ぜ、金属板にスポットし、真空で乾燥する。

レーザー光（殆どパルスを流す窒素レーザーで波長337nm）は，そのスポットで燃やし、それから、分析物はイオン化し揮発相になる。多くのレーザースポットは、signal-to-noise比(信号対雑音比)を改良するのに用いられる。マススペクトロメーターのタイプは殆どMALDIと組み合わせて用いられたのが、TOFマススペクトロメーターである。イオンはレーザーで離され、短い高ボルテージのインパルスで強調され、さらにそのmass(m)のチャージ（z）に対する比率（m/z）でわけ、イオン化した分解物を空にしたフィールドフリーのドリフトチューブ中を横断させる時間の測定（microsoconds）を行なう。重いイオンはより高い物よりもゆっくりとなる。分離したイオンはチューブの端に達し適当なレコーダーによって検知され、シグナルは各イオングループにインパクトする。デジタル化したデータは次々のレーザーショットから生まれ合計してTOFマススペクトラムを生じる。

　マドリードのMendezのグループは、初めてMALDI-TOFMSを用いてセリアック毒プロラミンの同定に用いた。この技術の高度の回析と感度はグリアジン、セカリン、ホールデング、アベニンのプロトン化した分子マスで用いられ，解決のための典型的なマスパターンを示した。著者らは，MALDI-TOFMSが食品中のグルテンの同定に有用な新たな技術である事を提案した。サンプル調製は全く簡単であるとわかった。実験はただプロラミンを含むアルコール抽出物をdetergent(octyl-β-D-glucopyranoside)と適当なマトリックス（sinapinic acid in acetonitrile (30%)/trifluoroacetic acid (0.1%)）と混合するだけである。この混合物の一部はステンレススチールの探りチップ（probe tip）先端にのせ、乾燥し、そしてMALDI-TOFマススペクトロメーターで測定する。装置は外部から牛血清アルブミン、馬心臓サイトクロームCの混合物で外部較正された。検出限界は、グリアジンでは0.01mg/mL抽出であった。プロラミン抽出物の還元剤利用はMALDI-TOF MSによる分析のハンデキャップにはならない。30種の食品（小麦パン、小麦デンプン、グルテンフリー食品）は、MALDI-TOF MSと研究室調製したサンドイッチELISA(Camafeita et al 1997b)とで同時に分析された。MS結果は、4-100mg グリアジン/kgのの範囲で直線関係あり、そしてELISA のそれと良い相関性がある。セリアック病、毒プロラミンの比較では、グリアジン、セカリン、ホールデン、アベニンが特徴的なマスプロフィールを示し、穀物種の差別ができた（Camafeita et al 1998）。小麦、らい麦、オートムギの異なった品種がほぼ同定され、一方大麦ホールデンは異なった品種で各マスプロフィールが生じた。最近、MALDI-TOF MSはビール中のグルテンによるペプチドを特徴づけることに利用された、それはサンドイッチELISAでは検知できなかった。最も相対的な違いはビール中のペプチドのMS プロフィールは低マス域（＜5000）であった。異なった国でつくられたビールはそれぞれ大きくペプチドのプロフィールが異なるので、このことは各工場での実施はセリアック病毒ペプチドの存在と定量測定に重要な役割りを演じるだろう。著者らはHPLC--MSをつなぐことによってアミノ酸配列の細かな分析をだし、それがセリアック病患者にとって必要な、性質、原因、可能な有毒性を明らかにする必要手段であると提案する。

　全体的にMALDI-TOF MSは食品中のグルテンの決定、定量測定の非--免疫的アプローチに高度に価値のあるものであるということだ。その限界はこの実験道具であり、そのため２−３の特別の研究室では分析を行なう事が出来る。この研究所のサービスは免疫法の信頼性をはっきりさせるのに特別に使うべきであり、選択的疑問サンプルの分析に使うべきである。

カラムクロマトグラフィー

カラムクロマトグラフィーはずっと穀物タンパク質の特徴づけ、分離、定量に使われてきた。特別にはゲル濾過（GP）クロマトグラフィーは分子量のちがいでわけ、逆相（RP）クロマトグラフィーでは異なった疎水性によって分けるが、これらは広く用いられている。HPLCの用いたベースは、分析の時間をかなり短くしたことである（時には30分以下）。タンパク質の検知、定量はカラムから出てくる物を、UV吸収で行いその範囲は200-220nmである。この波長では吸収ユニットは高度にタンパク質と相関性ある（Wieser et al 1998）。検知限界は約1-2μgタンパク質である。欠点は、検知技術はグルテンと非グルテンタンパク質の間の違いを見つけられぬことで、そこで複合食品の分析には使えない。にも関わらず、カラムクロマトグラフィーは利用価値がある。たとえば成分の決定、レファレンスタンパク質の定量あるいは他の方法の結果の判断に価値がある。

　しかしながら、特別な場合にはカラムクロマトグラフィーはグルテン測定に用いる事が出来る。GP-HPLCのSephadex 200HRへの利用は、一連の小麦デンプン中のグリアジンと全グルテン両方の定量に用いられ、次のステップの方法によった; 60%エタノール（グリアジン）10mLで１gの抽出、あるいは50% 2-propanol +還元剤（全グルテン）での抽出、遠心分離、真空遠心で4mLの上清の乾燥、500mL溶出用ソルベント中に溶かす、100-200μLをカラムにうちこみ、UV吸収は210 あるいは205nmの吸収測定。23デンプンサンプルの分析はグリアジン含量が15-574μg/kgであった。平均変異係数（average coefficient of variation）は２サンプルでは±2.6%であった。グリアジンのグルテニンに対する比率は大きな相違が見られ（0.2-4.9）,それは計算したグリアジンx 2=グルテンでDraft Revised Codex Studentによる計算とは合わない。さらに小麦デンプンに加えて，他の生の材料でグルテンフリー食品の生産に用いられるものがテストされた。グルテン測定は本質的にはアップルファイバー、ソバひきわり、スパイスミックス，クルミ、きび、米粉で可能であった。脱脂ミルク、大麦粉では、しかし、GP-HPLC法の正確な測定を邪魔する成分が入っていた。結論的にはカラムクロマトグラフィーは特別な場合にはグルテン分析の別報として使え、他の方法のコントロールになる。

結論と今後

小麦グルテンがセリアック病を悪化させるということが認知されてから、比較的ゆっくりプロセスでセリアック病--毒タンパク質の定量的測定に対する方法が進歩して来た。約30年がはじめのCodex Standard for Gluten Free Foods1981年の出来るまでにかかり、そこでは窒素測定の方法により小麦デンプンの分析のみという制限があった。このスタンダードの改訂は進行中で、the Draft Revised Codex Standard はCodex procedure のステップ６の段階である。一般的に大きな問題は、分析物（グルテンタンパク質）がタンパク質成分及び毒性の点で不完全な定義であることと、腹立たしい要因はグルテンタンパク質が食品加工中、しばしば変性するかあるいは酵素分解する点である。さらに適当なリフェレンスタンパク質の選択が、正確な結果を得るのに重要である点である。多くの分析法が免疫化学、PCR, MS,HPLCを基礎としてこの25年間発展してきたが、しかし僅か２−３のものが最小の要求性、感度、選択性，正確性、スピード利用性の点で合致したのみである。そこでDraft Revised Codex Standardは１つの方法の一般的アウトラインのみだし、免疫化学的なアプローチを薦めている。

　ELISAは最もしばしば用いられる免疫測定法であり、異なった試験システムがマーケットに出て、一部リングテストもうまくいっている。サンドイッチELISA はSkeritt＆Hill（1990）によってすすめられ、そこには加熱安定ω--gliadinに対しMAbが含まれていて、長年用いられてきた。この方法はしかしながら小麦、ライ麦、大麦種、各種のω--タイプタンパク質の異なった性質のため、システム的なエラーを生じる。さらに最近、サンドイッチELISAはMAbR5を使い、小麦、ライ麦，大麦プロラミンのセリアック病毒エピトープを認知した。検知リミットは3mgグルテン/kgであり、このテストはオートムギ、非毒性穀物とはクロス反応しない。加熱処理あるいはマトリックス効果から生じる問題は、このアッセイでは解決された。加水分解されたものに対して、修正した競合的 ELISAが提案された。試験キットはPWGグリアジンをレフェレンスタンパク質として含み、最近一括使用のために生産された。2005年に,R5 ELISAはth Codex Committee of Methods of Analysis and Sampling (CCMAS)よりタイプI法として推奨された。

　最近のRevised Draft Codex Standard and Proposed methodは、完全ではないけれどもそれはCodex Std 118-1981に比べて重要な進歩を示している。近々ではELISAはグルテン分析に対しての最初の選択をとるが、しかし変法がELISAの結果をコントロールするのに必要となるだろう。２点重要な問題が残っている。はじめのものはオート麦のセリアック病毒性の最終的な決定のことである。ここで問題は抗--アベニン抗体及びレフェレンスアベニンが試験システムに含まれるかどうかの問題である。２番目のことは、グルテン＝２Xプロラミンの計算式が根拠がなく、グルテリンに対しプロラミンの比率は強く穀物品種、種類にかかっており、穀物の違いによる加工品中で異なるためである。最近の研究は、小麦グルテニンがプロラミン同様セリアック病を悪化させる事を示し、相応するライ麦、大麦からのタンパク質でも有毒であった。しかしながら最近はグルテニンに対する一致した抗体もレフェレンスタンパク質もない。そこでさらに仕事はプロラミンとグルテリン両方の決定方法を進歩させ、小麦、ライ麦、大麦、可能性あるオートムギ貯蔵タンパク質の全タイプを含むレフェレンス材料の生産を進めている。